Ratones KO

Un ratón knockout o ratón KO es un ratón modificado por ingeniería genética para que uno o más de sus genes estén inactivados mediante una técnica llamada gene knockout.

Su propósito es comprender el papel de un gen que ha sido secuenciado pero del que se desconoce su función o se conoce de forma incompleta. Inactivando el gen y estudiando las diferencias que presenta el ratón afectado, los investigadores pueden inferir la probable función de ese gen. El ratón es el organismo modelo más próximo a los seres humanos en los que esta técnica se puede realizar con facilidad, de modo que es el sujeto favorito de los experimentos de noqueo, especialmente cuando se plantean cuestiones genéticas relacionadas con la fisiología humana. 

Procedimiento

Existen algunas variaciones sobre el procedimiento para producir ratones KO, siendo el siguiente el ejemplo más habitual.

1. Se aísla el gen que se desea noquear a partir de una genoteca de ratón. Posteriormente se diseña una nueva secuencia de ADN muy pararecida al gen original y su inmediata vecina, salvo que está cambiada lo suficiente para hacerla inoperante. Normalmente también se incluye en la nueva secuencia un gen marcador, que los ratones normales no poseen y que les confiere resistencia a ciertos agentes tóxicos o produce un cambio observable (p.ej. color o fluorescencia). Las oportunidades de un suceso de recombinación con éxito son relativamente bajas, de modo que la mayoría de las células alteradas tienen cambiado solo uno de ambos cromosomas. se dice que son heterocigotos.
2. A partir de un blastocisto de ratón (un embrión muy temprano que está formado por una masa esférica de células indiferenciadas rodeada de células extraembrionarias) se aíslan las células madre; después se cultivan in vitro. Como ejemplo, tomaremos una célula madre de un ratón blanco.
3. Las células madre del paso 2 se combinan con la nueva secuencia del paso 1. Esto se realiza mediante electroporación (empleando un pulso eléctrico para transferir ADN a través de la membrana celular). Algunas de las células madre electroporadas incorporarán la nueva secuencia en el lugar en el que el gen antiguo estaba en su cromosoma. A esto se le llama recombinación homóloga. La razón por la que tiene lugar este proceso es que ambas secuencias, la vieja y la nueva, son muy similares. Utilizando el gen marcador del paso 1, se puede aislar rápidamente las células que han incorporado la nueva secuencia.
4. Las células madre del paso 3 se insertan en un blastocisto de ratón. En este caso utilizamos blastocistos de ratón pardo. Estos blastocistos se implantan en el útero de una ratona, para llevar a término la gestación. Los blastocistos contienen dos tipos de células madre: las originales (ratón gris) y las modificadas (ratón blanco). El ratón neonato será por tanto una quimera genética: parte del cuerpo provendrá de las células madre originales y parte de las células modificadas. El pelaje también mostrará zonas blancas sobre pardo.
5. Los ratones neonatos sólo serán útiles si la secuencia ha sido incorporada a la línea germinal. Estos ratones se cruzan con otros del tipo blanco para obtener una progenie completamente blanca. Estos ratones aún contienen una copia funcional del gen y tienen que someterse a cruzamiento endógamo para producir un ratón que no lleva ninguna copia funcional del gen original (es decir, que sea homocigótico para ese alelo).